分光光度計的應用常識

分光光度計的應用常識

        分光光度計已成為現代分子生物學實驗室的常規儀器。常用于核酸、蛋白質定量和細菌生長濃度的定量。
        分光光度計的簡單原理
        分光光度計使用可產生多種波長的光源，通過一系列分光裝置，產生特定波長的光源。光源通過被測樣品后，部分光源被吸收，計算出樣品的吸光度值，從而轉化為樣品的濃度。樣品的吸光度與樣品的濃度成正比。
        核酸定量
        核酸定量是分光光度計Zui常用的功能。它可以量化溶解在緩沖液中的寡核苷酸、單鏈、雙鏈 DNA 和 RNA。核酸最高吸收峰的吸收波長為260nm。每種核酸的分子組成不同，因此其換算系數也不同。要對不同類型的核酸進行定量，必須事先選擇相應的系數。例如1OD的吸光度相當于50μg/ml dsDNA、37μg/ml ssDNA、40μg/ml RNA和30μg/ml Olig。將試驗后的吸光度值按上述系數換算得到相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原溶液和稀釋劑的體積，然后測試空白溶液和樣品溶液。然而，實驗并非一帆風順。不穩定的讀數可能是實驗者最頭疼的問題。儀器的靈敏度越高，吸光度的變化就越大。
        實際上，分光光度計的設計原理和工作原理是允許吸光度值在一定范圍內變化的，即儀器具有一定的準確度和精密度。例如，Eppendorf Biophotometer 的準確度≤1.0% (1A)。此類多次測試的結果在平均值約 1.0% 之間波動是正常的。此外，還應考慮核酸本身的理化性質以及溶解核酸的緩沖溶液的pH值和離子濃度。測試過程中，離子濃度過高，也會造成讀數漂移。因此，建議使用一定的pH值和低離子濃度。緩沖器，例如 TE，可以地穩定讀數。樣品的稀釋濃度也是一個不可忽視的因素：樣品中難免會有一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在會干擾測試效果。為了盡量減少顆粒對檢測結果的影響，要求核酸吸光度值至少大于0.1A，吸光度值優選為0.1～1.5A。在此范圍內，粒子干擾較小，結果穩定。
        所以表示樣品的濃度不能太低或太高（超出光度計的測試范圍）。最后是操作系數，如果混合充分，否則吸光度值太低，甚至為負；混合溶液不能有氣泡，空白溶液不能有懸浮物，否則讀數會急劇漂移；測試空白溶液和樣品必須使用同一個比色皿，否則濃度差異過大；換算系數與樣品濃度單位選擇相同；不能使用帶有磨損窗口的比色皿；樣品體積必須達到比色皿和許多其他操作所需的最小體積。
        除了核酸濃度，分光光度計還顯示幾個非常重要的比率來表示樣品的純度，例如A 260 / A 280的比率，用于評價樣品的純度，因為吸收峰蛋白質的波長為 280nm。對于純樣品，該比率大于 1.8 (DNA) 或 2.0 (RNA)。如果比值低于1.8或2.0，則表明受到蛋白質或酚類物質的影響。 A 230 表示樣品中含有糖類、肽類、酚類等污染物。相對純核酸的A 260/A 230 比值大于2.0。 A 320 檢測溶液的濁度和其他干擾因素。對于純樣品，A 320 一般為零。
        蛋白質的直接定量（UV 法）
        這種方法是在280nm波長直接檢測蛋白質。選擇Warburg公式，光度計可直接顯示樣品濃度，或選擇相應的換算方法將吸光度值換算成樣品濃度。
        蛋白質測定過程很簡單，先測空白溶液，再直接測蛋白質。因為buffer中有一些雜質，一般需要去掉320nm的“背景"信息，將此功能設置為“on"。與待測核酸類似，要求A 280的吸光度值至少大于0.1A，最佳線性范圍在1.0-1.5之間。實驗中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時，發現讀數“漂移"。這是正常現象。事實上，只要A 280 的吸光度值的變化范圍不超過1%，就說明結果非常穩定。
        漂移的原因是因為Warburg公式的吸光度值換算成濃度，乘以一定的系數，只要吸光度值變化一點，濃度就會被放大，使得結果很不穩定。
        直接蛋白質定量方法適用于檢測純度較高且成分相對單一的蛋白質。與比色法相比，UV直接定量法速度更快，操作簡單；但易受平行物質干擾，如DNA；此外，靈敏度低，需要更高濃度的蛋白質。